Tampão para PCR

MgCl2 (1M)                15 uL (M)

Tris HCl (1M)            100 uL (M)

KCl (1M)                    500 uL (M)

BSA (10mg/mL)         100 uL (M)

H2O                            285 uL

Cf: 15mM

TEB 10X

Ácido Bórico              55 g

Tris Base                    108 g

EDTA dissodium       9,3 g

H2O qsp                      1000 mL

Autoclavar e conservar em temperatura ambiente.

TEB 1X

TEB 10X                    10 mL

H2O qsp                      100 mL

Conservar em temperatura ambiente.

DNTP (Cf: 5mM ou 1,25mM cada)          

dATP (100mM)          12,5uL (1,25 mM)

dCTP (100mM)          12,5 uL (1,25 mM)

dTTP (100mM)          12,5 ul (1,25 mM)

dGTP (100mM)          12,5uL (1,25 mM)

H2O qsp                      1000 uL

Cf: 5mM

Diluição do dNTP para alfa talassemia

A + T
dATP (100 mM)                     4,0 uL

dTTP (100 mM)                     4,0 uL

H2O Mili Q                            192,0Ul

C + G
dCTP (100 mM)                     4,0 uL

dGTP (100 mM)                     4,0 uL

H2O Mili Q                            192,0 uL

Diluição de primers

Solução estoque com 100 uM = 100 pmol/uL

Primer (100 uM)         20 uL

Água qsp                    200 uL

Cf: 10uM                   

Brometo de Etídeo

Brometo                      0,15 g

H20                             10 mL

Cf: 10mg/mL

Tampão de carregamento (azul de bromofenol)

Sacarose                      4,0 g

Azul de bromofenol    0,025 g

H20 qsp.                      6,0 mL

Diluição de peso molecular (Ladder)

Solução mãe               1,5 uL

Azul de bromofenol

Ou corante do ladder  5,0 uL

H2O                            48,5 uL

Gel de agarose 2%

Agarose                      0,5 g

Tampão TEB 1X        25 mL

Gel de poliacrilamida 8%

Solução de poliacrilamida 30%   4 mL

H₂O                                                                       9,5 mL

TEB 10X                                                               1,5 mL

Persulfato de amônio                                    105 uL

TEMED                                                                5,5 uL

Coloração do gel de poliacrilamida

Solução fixadora

Etanol 96%                                         30 mL

Ácido Acético P.A.                           2,25 mL

Água Destilada                                 300 mL

Solução de nitrato de Prata

Nitrato de Prata                               0,3 g

Água                                                     4 mL

Solução reveladora

Hidróxido de sódio (NaOH)           4,5 g

Formaldeido                                      450 uL

Água                                                     150 mL

Coloração com Nitrato de Prata

Solução fixadora

Etanol P.A.                                         100 mL

Ácido Acético                                    5 mL

Água qsp                                             1000 mL

Tempo:30 minutos

Solução de nitrato de Prata

Nitrato de Prata                               1 g

Água qsp                                             1000 mL

Tempo: 20 – 30 minutos

Solução Reveladora

Hidróxido de Sódio                         30 g

Água qsp                                             1000 mL

Após diluir, adicionar o formol. (300 uL para cada litro de solução)

Trinta minutos ou até desaparecer a banda.

Solução de prata e reveladora podem ser armazenadas em frasco âmbar.

Após revelar, o gel pode ser deixado na solução fixadora.

Procedimentos de coloração com nitrato de prata:

1. Lavar o gel rapidamente com água destilada (2 vezes em 1 minuto).
2. adicionar solução fixadora, agitando delicadamente por 10 minutos.
3. Adicionar solução de nitrato de prata, agitando delicadamente por 15 minutos.
4. Lavar rapidamente com água destilada (2 vezes em 1 minuto).
5. Adicionar a solução reveladora, agitando delicadamente por 15 minutos.

Lavar com H₂O e adicionar solução fixadora por 5 minutos.