Padronização de PCR

• Variar quantidade de reagentes
• Utilizar reagentes novos
• Fazer sempre um branco
• Variar tempo de extensão, anelamento e desnaturação
• Diminuir TºC anelamento (quando não aparecer banda)
• Aumentar TºC anelamento (quando aparecer mais bandas do que o necessário)
• Fazer “Hot Start”
• Fazer pré-ciclo (já com a Taq, TºC desnaturação ± 4 a 5’ e TºC anelamento ± 2 a 3’, 1x)
• Aumentar ou diminuir quantidade de DNA
• Aumentar quantidade de ciclos (25 a 40 ciclos)
• Aumentar Taqpolimerase
• Utilizar reagentes de outras marcas
• Diluir novamente primers
• Verificar a qualidade do DNA
• Estocar reagentes sempre conforme o sugerido
• Esterelizar antes do PCR bancada, pipetas, etc, com álcool 70%
• Utilizar sempre água mili-Q
• Utilizar tubos e ponteiras estéreis e autoclavados
• Homogeneizar delicadamente as amostras e soluções
• Ao término da PCR colocar o produto amplificado a 4ºC
• Fazer PCR sempre no gelo