Protocolo para detecção da mutação C282Y no gene HFE

Protocolo de Amplificação

Sequências de Primers:

L282 5´ GGG TAT TTC CTT CCT CCA ACC 3´
R282 5´ CTC AGG CAC TCC TCT CAA CC 3´

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 441pb

Protocolo de Digestão

Rsa I – Biolabs®
Tampão Rsa I                2,1 µL
Rsa I (10000U/µL)      0,7 µL
H2O                                12,2 µL
Produto de PCR 5,0 µL

FastDigest-Rsa I – Fermentas
Tampão 1 X                               1,0 µL
FastDigest Rsa I (1FDU/µL) 0,3 µL
H2O                                           8,7 µL
Produto de PCR 5,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 37° C por 3 horas (Biolabs) ou por 5 minutos a 37° C (Fermentas)
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 2,0%, 80 volts 35 minutos.

Mutação no códon 282 (TGC > TAC), éxon 4 origina um sítio de restrição da Enzima Rsa I (gt↓ ac); assim, após a digestão o alelo normal gera 2 fragmentos: 296 e 145pb, e o alelo mutante gera 3 fragmentos: 296, 116 e 29 pb.