Protocolo para detecção da mutação H63D no gene HFE

Protocolo de Amplificação

Sequências de Primers:

L63 5´ ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC 3`
R63 5´ ATC CCC AGC CTT GTT AAC TG 3´

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 496pb

Protocolo de Digestão

Bcl I – Biolabs®
Tampão Bcl I                 2,1 µL
Bcl I (15000U/µL)       0,7 µL
H2O                               12,2 µL
Produto de PCR            5,0 µL

FastDigest-Bcl I – Fermentas
Tampão 1 X                                   1,0 µL
FastDigest Bcl I (1FDU/µL)      0,3 µL
H2O                                                8,7 µL
Produto de PCR                         10,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 50° C por 3 horas (Biolabs) ou por 5 minutos a 37° C (Fermentas)
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 2,0%, 80 volts 40 minutos.

Mutação no códon 63 (CAT > GAT), éxon 2 elimina um sítio de restrição da Enzima Bcl I (t¯gatca); assim, após a digestão o alelo normal gera 2 fragmentos: 352 e 144pb, e o alelo mutante gera 1 fragmento de 496 pb.