Protocolo para detecção de hemoglobina S (HbS)

Protocolo de Amplificação

Sequências de Primers:

P277 5´GGC AGA GCC ATC TAT TGC TTA 3`
P278 5´ACC TTA GGG TTG CCC ATA AC 3´

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 382 pb

Protocolo de Digestão

Ddel I – Biolabs
Tampão DdeI 10X        2,1 µL
DdeI (10.000U/mL)    1,0 µL
H2O                                 13,1uL
Produto de PCR          10,0 µL

Fast Dde I – Fermentas
Tampão FastDigest®                    1,0 µL
FastDigest DdeI (1 FDU/µL)       1,0 µL
H2O                                                  9,0 µL
Produto de PCR                            10,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 37° C por 3 horas (Ddel I) ou a 37° C por 5 minutos (FastDdeI).
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 1,5%, 80volts, 30 minutos.

Mutação no códon 6 (GAG > GTG) elimina um sítio de restrição da enzima DdeI (c/tnag); assim após a digestão o alelo normal gera 3 fragmentos: 201, 88 e 87 pb e o alelo mutante 2 fragmentos: 288 e 88pb.