Protocolo para detecção de hemoglobina B2 (HbB2)

Protocolo de Amplificação

Sequências de Primers:

HBB2 1 5´GGA GGA CAG GAC CAG CAT AA 3`
HBB2 2 5´CAG ATC CCC AAA GGA CTC AA 3´

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 372 pb

Protocolo de Digestão

Hha I – Biolabs
Tampão Hha I 10X            2,0 µL
Hha I (20.000U/mL)       2,0 µL
H2O                                    12,5 uL
Produto de PCR                 5,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 37° C por 3 horas (Hha I) ou a 37° C
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 1,5%, 80volts, 30 minutos.

Mutação no códon 16 (GGC > CGC) cria um sítio de restrição da enzima HhaI (gcg/c); assim após a digestão o alelo normal gera 1 fragmento de 372 pb e o alelo mutante 2 fragmentos: 147 e 225pb.