Protocolo para detecção do sítio 5’ γG (Xmn I) no cluster β globina (Haplótipo)
Protocolo de Amplificação
Seqüências de Primers:
H0 5´ AAC TGT TGC TTT ATA GGA TTT T 3´
H1 5´ AGG AGC TTA TTG ATA ACC TCA G 3´
- Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
- Tamanho do fragmento = 657pb
Protocolo de Digestão
Xmn I – Biolabs®
Tampão Xmn I (10 X) 1,5 µL
Xmn I (20.000U/mL) 0,15 µL
BSA (100X) 0,15 µL
H2O 3,2 µL
Produto de PCR 10,0 µL
- Colocar em banho-maria a 37° C por 3 horas.
- A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 1,5%, 80 volts 30 minutos.
A presença do polimorfismo na região 5` g G , reconhecido pela enzima Xmn I (gaann↓nnttc), após a digestão, gera 2 alelos com fragmentos de 450 e 200 pb e a ausência do polimorfismo gera 1 fragmento de 657 pb.
