Protocolo para detecção do sítio IVS-II γA (Hind III) no cluster β globina (Haplótipo)

Protocolo de Amplificação

Seqüências de Primers:

H3 5´ TGC TGC TAA TGC TTC ATT ACA A3´
H4 5´ TAA ATG AGG AGC ATG CAC ACA C 3´

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 760 pb

Protocolo de Digestão

Hind III – Biolabs
Tampão Hind III (1 X)          1,5 µL
Hind III (20.000U/mL)       0,5 µL
H2O                                          3,2 µL
Produto de PCR                   10,0 µL

FastDigest-Hind III – Fermentas
Tampão 10 X                                            1,0 µL
FastDigest Hind III (1FDU/µL)           0,3 µL
H2O                                                           8,7 µL
Produto de PCR                                      5,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 37° C por 3 horas (Biolabs) ou a 37° C por 5 minutos (Fermentas)
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 1,5%, 80 volts 30 minutos.

A presença do polimorfismo na região IVS-II γA, reconhecido pela enzima Hind III (a↓agctt), após a digestão, gera 2 alelos com fragmentos de 400 e 360 pb e a ausência do polimorfismo gera 1 fragmento de 760 pb.