Protocolo para detecção da mutação S65C no gene HFE

Protocolo de Amplificação

Sequências de Primers:

L63 5´ ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC 3`
R63 5´ ATC CCC AGC CTT GTT AAC TG 3´

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 496pb

Protocolo de Digestão

FastDigest-Hinf I – Fermentas
Tampão FastDigest                         1,0 µL
FastDigest Hinf I (1FDU/µL)       0,3 µL
H2O                                                   8,7 µL
Produto de PCR                            10,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 37° C por 5 minutos
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 2,0%, 80 volts 40 minutos.

Mutação no códon 65 (AGT > TGT), éxon 2, elimina um sítio de restrição da enzima Hinf I (g↓antc); assim, após a digestão o alelo normal gera 4 fragmentos: 274, 147, 69 e 6 pb, e o alelo mutante gera 3 fragmentos: 274, 216 e 6 pb.