Protocolo para detecção de hemoglobina G - Philadelphia (Hb G - Philadelphia)

Protocolo de Amplificação

Sequências de Primers:

LH1 5`AGG CCC TGG AGA GGT GAG 3`
RIGHT 5`GGA GCT GTG CAG AGA AGA GG 3`

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 481 pb

Protocolo de Digestão

Sty I – Biolabs®
Tampão Taq I 1X                10,0 µL
Sty I   (10000U/mL)              1,5 µL
BSA                                       0,25 µL
Produto de PCR                  10,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 37° C por 3 horas.
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 1,5%, 80 volts 40 minutos.

Mutação no códon 69 (AAC > AAG) origina um sítio de restrição da Enzima Sty I (cc↓wwgg); assim, após a digestão o alelo normal não clivado 481pb e, o alelo mutante gera 2 fragmentos: 243 e 238 pb.