Protocolo para detecção de hemoglobina -Los Angeles (HbD-Los Angeles)

Protocolo de Amplificação

Sequências de Primers:

CD1 5´ TGC CTC TTT GCA CCA TTC TA 3´
CD2 5´ GAC CTC CCA CAT TCC CTT TT 3´

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 564 pb

Protocolo de Digestão

EcoR I – Biolabs®
Tampão EcoR I 1X             5,0 µL
EcoR I (20.000U/mL)      1,0 µL
Produto de PCR                  5,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 37° C por 3 horas.
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 1,5%, 80 volts 30 minutos.

Mutação no códon 121 (GAA > CAA) elimina um sítio de restrição da enzima EcoR I (g↓aattc); assim, após a digestão o alelo normal gera 2 fragmentos: 296 e 268 pb e o alelo mutante gera 1 fragmento de 564 pb.