Protocolo para detecção do sítio IVS-II γG (Hind III) no cluster β globina (Haplótipo)

Protocolo de Amplificação

Sequências de Primers:

H2 5´ AAG TGT GGA GTG TGC ACA TGA 3´
H3 5´ TGC TGC TAA TGC TTC ATT ACA A3´

  • Análise da amplificação em gel de agarose 1,5 %, 80 Volts, 20 minutos
  • Tamanho do fragmento = 782pb

Protocolo de Digestão

Hind III – Biolabs
Tampão Hind III (1 X)                    1,5 µL
Hind III (20.000U/mL)                0,5 µL
H2O                                                   3,2 µL
Produto de PCR                             10,0 µL

FastDigest-Hind III – Fermentas
Tampão 10 X                                          1,0 µL
FastDigest Hind III (1FDU/µL)         0,3 µL
H2O                                                         8,7 µL
Produto de PCR                                    5,0 µL

  • Colocar em banho-maria a 37° C por 3 horas (Biolabs) ou a 37° C por 5 minutos (Fermentas)
  • A análise da digestão deverá ser realizada em gel de agarose 1,5%, 80 volts 30 minutos.

A presença do polimorfismo na região IVS-II γG, reconhecido pela enzima Hind III (a↓agctt), após a digestão, gera 2 alelos com fragmentos de 436 e 346 pb e a ausência do polimorfismo gera 1 fragmento de 782 pb.